Annexin V-iFluor 350標(biāo)記是美國(guó)AAT Bioquest研發(fā)的用于檢測(cè)細(xì)胞功能的探針，膜聯(lián)蛋白是鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白家族。 它們富含真核生物，屬于參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的普遍存在的細(xì)胞質(zhì)蛋白家族。 膜聯(lián)蛋白V的優(yōu)先結(jié)合配偶體是磷脂酰絲氨酸（PS），其通常保持在細(xì)胞膜的內(nèi)葉（細(xì)胞質(zhì)側(cè)）。 在細(xì)胞凋亡中，PS被轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜的外部小葉。 磷脂酰絲氨酸在細(xì)胞表面上的出現(xiàn)是細(xì)胞凋亡的初始/中間階段的通用指示，并且可以在觀察到形態(tài)變化之前檢測(cè)到。 我們的膜聯(lián)蛋白V結(jié)合物是一組監(jiān)測(cè)細(xì)胞功能的工具，旨在通過測(cè)量磷脂酰絲氨酸的易位來監(jiān)測(cè)細(xì)胞凋亡。

膜聯(lián)蛋白V結(jié)合物在Ca2+存在下與凋亡細(xì)胞表面上的PS結(jié)合，它也可以通過壞死細(xì)胞膜或死細(xì)胞并與細(xì)胞內(nèi)部的PS結(jié)合。 因此，我們建議將細(xì)胞不可滲透的核染色與膜聯(lián)蛋白V結(jié)合物結(jié)合使用，以區(qū)分死細(xì)胞和凋亡細(xì)胞。百螢生物是AAT Bioquest的中國(guó)代理商，為您提供優(yōu)質(zhì)的Annexin V-iFluor 350檢測(cè)試劑。 

分析方案

概述

用測(cè)試化合物（200μL/樣品）制備細(xì)胞

添加Annexin V結(jié)合物測(cè)定溶液

室溫孵育30-60分鐘

用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡分析

1.用膜聯(lián)蛋白V綴合物制備和孵育細(xì)胞：

1.1制備膜聯(lián)蛋白V結(jié)合測(cè)定緩沖液：10mM HEPES，140mM NaCl和2.5mM CaCl2，pH 7.4。

1.2用測(cè)試化合物處理細(xì)胞一段所需的時(shí)間（用星形孢菌素處理的Jurkat細(xì)胞4-6小時(shí)）以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

1.3離心細(xì)胞，得到1-5×105個(gè)細(xì)胞/管。

1.4將細(xì)胞重懸于200μL膜聯(lián)蛋白V結(jié)合測(cè)定緩沖液中（來自步驟1.1）。

1.5在細(xì)胞中加入2μL膜聯(lián)蛋白V結(jié)合物。

可選：在細(xì)胞內(nèi)加入死細(xì)胞染色劑如碘化丙錠，用于壞死細(xì)胞。

1.6在室溫下孵育30至60分鐘，避光。

1.7在用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡分析細(xì)胞之前，加入300μL膜聯(lián)蛋白V結(jié)合測(cè)定緩沖液（來自步驟1.1）以增加體積（參見下面的步驟1.8）。

1.8使用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡監(jiān)測(cè)熒光強(qiáng)度（參見下面的步驟2或3）。

2.使用流式細(xì)胞儀分析：

通過使用具有適當(dāng)過濾器的流式細(xì)胞儀來量化膜聯(lián)蛋白V綴合物。

注意：粘附細(xì)胞上的膜聯(lián)蛋白V結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)分析未經(jīng)常檢測(cè)，因?yàn)樵诩?xì)胞分離或收獲期間可能發(fā)生特定的膜損傷。 然而，Casiola-Rosen等人先前報(bào)道了利用膜聯(lián)蛋白V對(duì)貼壁細(xì)胞類型進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)的方法。 和van Engelend等人（見參考文獻(xiàn)1和2）。

3.使用熒光顯微鏡分析：

3.1移取步驟1.6的細(xì)胞懸液，用膜聯(lián)蛋白V結(jié)合測(cè)定緩沖液（來自步驟1.1）沖洗1-2次，然后用膜聯(lián)蛋白V結(jié)合測(cè)定緩沖液（來自步驟1.1）重懸細(xì)胞。 將細(xì)胞添加到蓋有玻璃蓋玻片的載玻片上。

注意：對(duì)于粘附細(xì)胞，建議直接在蓋玻片上生長(zhǎng)細(xì)胞。 與膜聯(lián)蛋白V綴合物孵育（步驟1.6）后，用膜聯(lián)蛋白V結(jié)合測(cè)定緩沖液（來自步驟1.1）沖洗1-2次，并將膜聯(lián)蛋白V結(jié)合測(cè)定緩沖液（來自步驟1.1）加回到蓋玻片中。 在玻璃載玻片上翻轉(zhuǎn)蓋玻片并觀察細(xì)胞。 在與膜聯(lián)蛋白V綴合物孵育后，細(xì)胞也可以在2％甲醛中固定，并在顯微鏡下觀察。

3.2在熒光顯微鏡下用適當(dāng)?shù)臑V光片分析膜聯(lián)蛋白V綴合物的凋亡細(xì)胞

數(shù)據(jù)分析

        下圖是使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)膜聯(lián)蛋白V-mFluor Violet 450與磷脂酰絲氨酸在Jurkat細(xì)胞凋亡中的結(jié)合活性的實(shí)例。 在活的非凋亡細(xì)胞中，膜聯(lián)蛋白V-mFluor Violet 450檢測(cè)非誘導(dǎo)細(xì)胞中的先天性細(xì)胞凋亡，其通常為所有細(xì)胞的2-6％。 在凋亡細(xì)胞中，膜聯(lián)蛋白V-mFluor Violet 450與磷脂酰絲氨酸結(jié)合，磷脂酰絲氨酸位于細(xì)胞膜的外部小葉上，導(dǎo)致染色強(qiáng)度增加。

圖1.在Jurkat細(xì)胞中檢測(cè)膜聯(lián)蛋白VmFluor Violet 450和磷脂酰絲氨酸的結(jié)合活性。 將Jurkat細(xì)胞在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中不用（藍(lán)色）或用1μM星形孢菌素（紅色）處理5小時(shí)，然后用Annexin V-mFluor Violet 450染色30分鐘。 使用FACSCalibur（Becton Dickinson，San Jose，CA）流式細(xì)胞儀，使用紫外激光在Ex / Em = 405 / 450nm下測(cè)量膜聯(lián)蛋白V-mFluor Violet 450的熒光強(qiáng)度。

參考文獻(xiàn)

Resources-Application Notes Phenotypic and Epigenetic Mechanism of Action Determinations of Histone Methylase and Demethylase Inhibitors using Digital Widefield Microscopy
Authors: Brad Larson, Peter Banks
Journal: Experimental Biology (2017)

Targeted Magnetic Intra-Lysosomal Hyperthermia produces lysosomal reactive oxygen species and causes Caspase-1 dependent cell death
Authors: Pascal Clerc, Pauline Jeanjean, Nicolas Halalli, Michel Gougeon, Bernard Pipy, Julian Carrey, Daniel Fourmy, Véronique Gigoux
Journal: Journal of Controlled Release (2017)